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26 Mayo, 2021
Después de la recolección y debida preservación de los indicios biológicos, la primera etapa del análisis de ADN consiste en la extracción y purificación del material genético, la segunda etapa consiste en la cuantificación del ADN.


El propósito es evaluar, por un lado, si es posible avanzar con el análisis, y por el otro calcular la cantidad de ADN a utilizar en la reacción de amplificación o PCR, pues con poca cantidad no se obtendrá un perfil genético o el mismo resultará incompleto, por el contrario con un exceso de ADN se obtendrá un electroferograma con picos fuera de escala que pueden provocar la aparición de falsos picos. Además, las muestras forenses que contienen ADN son a menudo mezclas que pueden incluir ADN no humano, por ejemplo, puede estar presente ADN microbiano, por tanto, es necesario utilizar métodos de cuantificación de ADN específicos para seres humanos para determinar selectivamente la cantidad de ADN humano presente.

Aunque hay una amplia variedad de métodos para cuantificar ADN, que incluyen absorbancia con luz UV (Ultra Violeta), siembra en geles de agarosa y posterior tinción con colorantes específicos, slot blot (transferencia del ADN a una membrana y posterior tinción con sondas específicas radiactivas o fluorescentes), etc., éstos son laboriosos y no tienen la sensibilidad que exigen los kits de amplificación de STRs utilizados actualmente. Fueron desarrollados también métodos que utilizan la PCR tradicional, que es mejor que los mencionados previamente porque mide la «funcionalidad» de la reacción de PCR.
Los primeros métodos para la cuantificación del ADN normalmente implicaban la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm o la fluorescencia después de teñir un gel de rendimiento con bromuro de etidio. Sin embargo, estos métodos no son muy sensibles, consumen la muestra y no son específicos para ADN. Por su parte, el método más utilizado en los laboratorios forenses durante finales de la década de 1990 y principios del siglo XXI fue el denominado procedimiento de transferencia por ranura (Slot blot), el cual se describió por primera vez con sondas radiactivas, pero luego se modificó y comercializó con formatos de detección quimioluminiscentes o colorimétricos. También se pueden cuantificar pequeñas cantidades de ADN utilizando un método de colorante intercalante fluorescente. Los colorantes intercalados, generalmente moléculas planas, pueden deslizarse entre pares de bases de ADN sin romper la doble hélice del ADN. Las muestras de ADN simplemente se agregan a una solución que contiene el tinte intercalante fluorescente. La fluorescencia, proporcional a las cantidades de ADN, se mide usando un espectrofluorómetro.

Alrededor del 2000, Promega desarrolló un sistema de cuantificación de ADN humano, conocido como AluQuant, que permitió una detección bastante sensible de ADN utilizando repeticiones Alu (Secuencias de ADN repetidas distribuidas a lo largo del genoma. Son las secuencias repetidas más frecuentes, representando el 5% del genoma humano. Su nombre se debe a que son reconocidas y cortadas por la enzima de restricción Alu) que abundan en el genoma humano. El ensayo AluQuant posee un rango de 0,1 a 50 ng para el ADN humano y se puede automatizar en una estación de trabajo robótica de manipulación de líquidos. Si bien este ensayo fue utilizado durante varios años por laboratorios de Ciencias Forenses, se volvió obsoleto con la introducción de ensayos de PCR cuantitativos en tiempo real.

Actualmente esta es la metodología más utilizada, también conocida como PCR cuantitativa o qPCR, que además de medir la funcionalidad del ADN purificado es más sensible que los otros métodos. Existen una gran variedad de kits, ofrecidos por distintas compañías, que pueden utilizarse, por ejemplo los que ofrece ZOGBI. Ellos son capaces de establecer si en la muestra hay inhibidores, pueden cuantificar ADN total y masculino, y los más novedosos pueden determinar el grado de degradación del ADN molde. En resumen esta técnica puede arrojar resultados sobre la cantidad y la calidad del ADN.

Autor :Equipo Expresión Forense