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27 Mayo, 2021
La necesidad de realizar una prueba de cuantificación de ADN surge de determinar la cantidad de ADN "amplificable".


La necesidad de realizar una prueba de cuantificación de ADN surge de determinar la cantidad de ADN "amplificable". Siguiendo el principio de amplificación por PCR, donde la cantidad de producto de PCR amplificado se correlaciona con la concentración inicial de ADN, se puede determinar la concentración de ADN de una muestra. Existen dos tipos de métodos de PCR cuantitativos: 1) Los métodos de PCR de punto final, en donde se mide la cantidad de producto amplificado al final de la PCR. 2) Los métodos de PCR en tiempo real, en donde se puede cuantificar el ADN amplificado durante la fase exponencial de la PCR. En este caso, el resultado de la cuantificación no se ve comprometido por ligeras variaciones en las condiciones de la PCR, con lo que se obtiene mayor precisión en la cuantificación de las secuencias de interés..

PCR Cuantitativa en Tiempo Real

Existen diferentes factores que pueden interferir en la reacción de amplificación por PCR, entre ellos la presencia de inhibidores, ADN muy degradado, cantidad insuficiente de ADN o una combinación de todos estos. Por ello para que una prueba pueda reflejar con precisión la calidad y cantidad de ADN presente en una muestra extraída son beneficiosos los ensayos de PCR "en tiempo real" que proporcionan dicha evaluación.

La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utiliza un indicador fluorescente para controlar la acumulación de productos amplificados durante la PCR. Además, la técnica se puede multiplexar para detectar más de un tipo de secuencia específica de ADN en una sola reacción. Se encuentran disponibles kits comerciales de qPCR para la cuantificación del ADN humano y del ADN del cromosoma Y, además, es posible el método qPCR para la cuantificación del mtDNA. Las secuencias diana se amplifican y detectan mediante el mismo instrumento, y la fluorescencia del indicador se monitoriza externamente, esto tiene la ventaja de que al no ser necesario abrir los tubos de reacción se minimiza la contaminación por aerosoles y, por tanto, reduce el riesgo de falsos positivos.

Un ejemplo de estos kits es el Sistema Power Quant® de Promega que ofrece ZOGBI, este ensayo PCR está basado en una sonda de 5 colores y 4 objetivos que cuantifica la cantidad total de ADN autosómico y cromosómico Y amplificable en un solo ensayo, además detecta constantemente ADN humano de 0.5pg / μl, así como los inhibidores de PCR y evalúa la integridad del ADN de su muestra. Este sistema ofrece opciones flexibles para la curva estándar de 4 puntos a 7 puntos. El kit contiene un control interno de PCR (IPC) para detectar resultados falsos negativos que pueden ocurrir en presencia de inhibidores de PCR.

Autor :Equipo Expresión Forense